為什么你的熒光定量PCR實驗中沒有CT值？看看這幾點你就明白了

熒光定量PCR是生物醫(yī)學中常用的檢測核酸病毒的方法之一，由此，這幾年P(guān)CR 儀也成了近幾年臨床檢測和分子生物學研究的必備實驗室設(shè)備。 我們知道CT值是PCR 擴增曲線中的重要參數(shù)，那么CT值是什么？它與 PCR擴增存在什么關(guān)系？為什么有的時候基因擴增實驗中會出現(xiàn)CT 值異常甚至缺少CT值的情況？

什么是CT值？

在熒光定量PCR擴增實驗中，當擴增產(chǎn)物的熒光信號（Fluorescence signal）達到設(shè)定的熒光閾值（FLUORESCENCE threshold）時的所對應的擴增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。也可以理解為在qPCR實驗過程中初始模板擴增到一定產(chǎn)物量值時，所對應的循環(huán)數(shù)。 CT 值的表達公式為：擴增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個數(shù)。

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通常QPCR實驗中CT值的異常主要有以下幾種情況：

一、擴增曲線正常，CT值偏大或偏小

從CT值表達公式中我們可以看出初始模板的質(zhì)量和擴增效率，會直接影響到CT值的大小。 如果擴增起始模板量濃度高或引物設(shè)計不合適那么所用的循環(huán)數(shù)就會小，即出現(xiàn)Ct值過??；反之，起始模板量濃度過低，Ct值會偏大。 PCR擴增效率與CT 值也是成反比關(guān)系，擴增效率高則CT值小，擴增效率低則需要要用到的循環(huán)數(shù)增加所對應的CT值也會偏高。另外，合理的引物設(shè)計，防污染試劑的應用也會影響到CT值的大小。

二、 有擴增曲線，但卻沒有CT值，CT值顯示狀態(tài)為Undetermined

這種情況下你通常也會發(fā)現(xiàn)由于閥值位置不正常正常導致熒光閾值線與擴增曲線沒有交點，所以儀器顯示狀態(tài)為Undetermined。出現(xiàn)這種如果擴增模板濃度是正常的，那么多數(shù)原因可能是由于系統(tǒng)界面參數(shù)設(shè)置錯誤所導致的。如果參與擴增的模板并非所有的孔，而系統(tǒng)界面在所有的 （C-H行）都默認 設(shè)上了target和 sample參與CT值計算。這個時候系統(tǒng)會默認所有孔參與熒光定量 PCR實驗 。導致CT值錯誤。如果我們把無樣品C-H 行數(shù)的target和sample 前面的“√” 清除后重新分析計算，就會得到正常的熒光閾值線 CT 值了。

三、 有擴增曲線，閾值線的位置也正常，但大多數(shù)孔仍然不顯示CT值。

當系統(tǒng)界面C-H行 顯示出現(xiàn)異常提示（比如黃色三角形標示），在數(shù)據(jù)分析中會再很多孔內(nèi)出現(xiàn) BLFAIL提醒。這表明基線分析失敗，如果確定我們在反應物中加了熒光染料，如果加了，那么這種 熒光值偏低現(xiàn)象，可能由于使用了透光性不好PCR 耗材或不配套的耗材所導致。這種情況較容易出現(xiàn)在底部或側(cè)邊掃描檢測的PCR儀器中；朗基的 Q2000系列采用的頂部CCD 實時檢測技術(shù)甚至可以用完全不透明的白管進行實驗，所以一般不會存在這種問題。

四、 還有一種情況較為常見也就是擴增曲線不正常，CT值都顯示“Undetermined”。

此時，如果在熒光定量PCR檢測報告頁面出現(xiàn)了ROX的熒光值 為0的情況，很可能是使用了不含ROX 試劑而系統(tǒng)參數(shù)中未做修改所造成，及時在分析設(shè)置中將Passive reference dye的ROX 改成None，再重新分析即可正常顯示。有些沒有ROX 校正的PCR 儀中也較容易出現(xiàn)此類問題。

從上面Qpcr實驗中常幾種常遇到的幾種情況中可以看出：要想獲得 準確的pcr實驗結(jié)果，實驗的設(shè)計及樣本、配套試劑耗材、儀器類型的選擇、正確的軟件操作等都與實驗本身密不可分。

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